此前，艾偉拓產品團隊通過多期軟文與視頻，分析了生物制劑中緩沖體系的重要作用及篩選考量，歡迎您前往艾偉拓公眾號對之前的幾篇文章進行回顧。

本期，艾偉拓產品團隊延續(xù)這一話題，對抗體等蛋白制劑在純化工藝中的緩沖體系選擇進行討論。

抗體等蛋白類生物制劑的聚集，可能會影響產品的潛在免疫原性，其電荷異質性也可能影響treatment的安全性和有效性。

此前，我們主要將目光聚焦于成品制劑的穩(wěn)定性。但值得注意的是，抗體蛋白在加工純化等工藝過程中的穩(wěn)定性也需要給予關注。為此，艾偉拓產品團隊結合一篇來自印度理工學院的研究論文，對抗體蛋白純化主要工藝步驟中的緩沖體系選擇進行討論。

01 蛋白A親和層析

蛋白A親和層析是抗體產品純化工藝中普遍存在的捕獲步驟，Protein A的成功是由于其特別而重要的能力，可以有效地捕獲抗體蛋白產物(回收率為95-99%)，同時去除絕大多數(shù)宿主細胞雜質(宿主細胞蛋白質和核酸)。

蛋白A的洗脫通常在低pH下進行，隨后在低pH下進行病毒失活。然而，低pH與抗體蛋白的聚集有關，這是由于Fc結構域的結構變化導致洗脫過程中可溶性高分子量聚集體和/或不溶性沉淀物的增加。

使用SEC（分子排阻色譜）分析抗體聚集(圖1A)?？梢钥闯觯?°C和30°C下，即使在無鹽緩沖液中保存長達7天，抗體蛋白聚集程度的增加也很小。only的例外是檸檬酸緩沖液，即使在沒有鹽的情況下也能觀察到相當數(shù)量的聚集。

鹽的加入(離子強度~0.2 ~ 0.3 mol/L)幾乎在所有情況下都能突出提高抗體蛋白聚集程度，在30℃時效果更明顯。

由此可以得出初步結論：

① 鹽和高溫的結合導致抗體蛋白聚集性突出增加；

② 與醋酸鹽和甘氨酸緩沖液相比，檸檬酸緩沖液傾向于導致更高的蛋白聚集，特別是在高溫下。

因此，建議在低溫條件下進行蛋白A親和層析并保存層析產物，如果保持在較高的溫度下，則產物保持時間應限制在幾個小時內，盡快進入下一個純化處理步驟。

02 陽離子交換層析

對于抗體類藥物而言，蛋白聚集是較大的不穩(wěn)定性來源。此外，電荷異質性也會導致抗體蛋白的產品異質性。

離子交換層析廣泛應用于抗體蛋白純化工藝，研究表明該步驟中電荷異質性是影響抗體蛋白穩(wěn)定性的主要因素。圖3A為該研究選擇的不同緩沖條件下抗體蛋白電荷異質性隨時間的變化數(shù)據。

從總體上看，隨著時間的推移，主峰含量呈下降趨勢，其中磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)的下降幅度較大，磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)的下降幅度較小。同時，鹽的加入使主峰含量降低。

對于醋酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液，發(fā)現(xiàn)主峰含量在1周內的變化為小于2%。

在pH為6.5時，磷酸鹽緩沖液中抗體蛋白的主峰含量發(fā)生了明顯變化，從圖3B中可以看出，時間和pH值對帶電變異體的形成都起著重要的作用。

從圖3A中也可以看出，在pH為7.5時，磷酸鹽緩沖液中抗體蛋白的主峰含量變化可以忽略不計，而在pH為6.5時，相同的緩沖液發(fā)生了突出變化。在pH值為6.5時觀察到的一個有趣現(xiàn)象是，隨著時間的推移，主峰含量先降低后增加。

03 陰離子交換層析

圖4A顯示了所選擇的不同緩沖條件下(Tris-HCl pH 7.2和Tris-HCl pH 8)主峰含量隨時間變化的數(shù)據?？梢钥闯?，在pH 7.2時，變化不突出。

然而，在pH值為8時，抗體蛋白產物的電荷異質性發(fā)生了相當大的變化，在較高的溫度下變化更大。鹽的存在對主峰含量的影響很小。

圖4B展示了統(tǒng)計建模的結果?？梢钥闯觯c陽離子交換層析一樣，pH和時間對確定主峰含量起關鍵作用。

與之前一樣，用pH為8的Tris-HCl緩沖液對數(shù)據構建等高線圖?？梢钥闯?，隨著溫度的升高，設計空間減小。允許的離子強度隨著保持時間的增加而降低，直到100 h后超過允許的極限。在30℃時，離子強度不建議大于0.05，純化中間產品保持時間不建議超過60h，以避免主峰含量低于限度。

04 討論

低pH導致抗體蛋白聚集。在遠離pI的低pH條件下，抗體蛋白是高電荷的，導致電荷排斥，這使蛋白構象不穩(wěn)定，這種結構擾動會促進抗體的展開介導聚集。這是常規(guī)蛋白A層析和病毒滅活過程步驟的條件下抗體蛋白突出聚集的主要原因。

在高pH (pH 8，接近蛋白的pI)的條件下，觀察到抗體蛋白的電荷異質性增加。主峰含量的下降是由于酸性變體的增加導致。天冬氨酸殘基的脫酰胺化是導致抗體降解和療效下降的常見原因。這也是電荷異質性在離子交換層析步驟中突出影響蛋白穩(wěn)定性的主要原因。

05 小結

該研究發(fā)現(xiàn)，蛋白聚集是蛋白A親和層析和病毒失活步驟較大允許保持時間的主要決定因素，而電荷異質性的變化決定了陽離子交換和陰離子交換步驟的較大允許保持時間。這其中，適宜緩沖體系的選擇對抗體蛋白在純化過程中的穩(wěn)定發(fā)揮著很大的作用。

在常見的蛋白A親和層析條件下，高離子濃度和高溫會導致抗體蛋白聚集突出增加；緩沖體系選擇方面，與醋酸鹽和甘氨酸緩沖液相比，檸檬酸緩沖液傾向于導致更高的蛋白聚集。而在離子交換層析中，離子強度、溫度及pH值對抗體蛋白的電荷異質性有較大影響。

總而言之，除了制劑中的緩沖體系，還應關注抗體等蛋白制劑在蛋白純化等過程工藝步驟中的緩沖體系選擇，不同的緩沖體系（種類，pH，離子濃度）會對抗體蛋白的穩(wěn)定性產生不同程度的影響，直接影響中間產物的較大允許保持時間，進而影響抗體制劑的穩(wěn)定性與treatment效果。

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